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Jul 01, 2023

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Nature (2023) この記事を引用 449 アクセス 304 Altmetric Metrics 詳細 抗生物質結合部位は必須酵素の重要なドメインに位置しており、世界で広く研究されています。

自然 (2023)この記事を引用

449 アクセス

304 オルトメトリック

メトリクスの詳細

抗生物質結合部位は必須酵素の重要なドメインに位置しており、耐性変異との関連で広く研究されています。 ただし、彼らの研究はポジティブセレクションによって制限されています。 この制約を克服するために多重ゲノム工学 1 を使用して、大腸菌 RNA ポリメラーゼ (RNAP) のリファンピシン結合部位全体を含む 760 個の単一残基変異体のコレクションを生成し、特性評価しました。 薬物と酵素の相互作用を遺伝的にマッピングすることにより、変異によってリファンピシンの結合が大幅に強化または破壊されるαヘリックスを特定します。 私たちは、致死的な DNA 切断を誘導することで、抗生物質の結合を延長し、リファンピシンを静菌剤から殺菌剤に変換する変異をこの領域で発見しました。 後者は複製依存性であり、リファンピシンがプロモーターで有害な転写複製競合を引き起こすことによって細胞を破壊することを示しています。 また、RNAP の速度を大幅に向上させる追加の結合部位変異も特定しました。Fast RNAP は細胞のヌクレオチドを枯渇させ、さまざまな抗生物質に対する細胞の感受性を変化させ、低温増殖の利点をもたらします。 最後に、天然の rpoB 配列の多様性をマッピングすることにより、RNAP 特性を変化させたり、薬剤耐性を付与したりする機能的なリファンピシン結合部位の変異が自然界で頻繁に発生していることを発見しました。

臨床耐性と闘う上でのその重要性に加えて、抗生物質耐性変異体の研究により、基本的な生物学的プロセスの理解も進んでいます5。 抗生物質は細菌の生存に必要な酵素を標的とすることによって機能するため、耐性変異は、RNA ポリメラーゼ 6、7、8、9、10 (RNAP) やリボソーム 11、12、13、14 などの必須の細胞機構の特性評価に役立っています。 耐性変異は、抗生物質の標的の機能を誤って変化させることが示されており、必須酵素のさまざまな機能 6,11,15、調節 16、および生理学的属性 12,17,18 について新たな洞察が得られ、表現型のホットスポットとして抗生物質の結合部位が特定されています。

細菌性 RNAP の特異的阻害剤であるリファンピシン (Rif) の結合部位は、高解像度の構造によって明確に定義されており 8、10、19 、耐性変異体からの初期の遺伝的発見を裏付けています 20。 Rif の高親和性結合は、3 ヌクレオチドの長さを超えた新生 RNA の伸長を防ぎ、耐性変異体では Rif 結合が失われます。 集合的に、耐性変異体は、転写サイクルの各段階での変異体酵素の特性の変化の結果として、興味深い幅広い表現型を示します 15、16、21、22、23、24。 Rif は高頻度耐性で有名ですが 4,25,26、既知の耐性変異体のスペクトルでは、RNAP の β サブユニットのこの領域の非重複変異スペースは 5% 未満です。 したがって、Rif 結合部位の機能的理解はまだ不完全です。

配列決定と並行した多重自動ゲノムエンジニアリング (MAGE) には、ポジティブセレクションや低い突然変異率の制約がありません 27、28、29。 このシステムは、非常に高い効率と特異性で細菌染色体上の対象領域への突然変異の導入とモニタリングを可能にし 1,30,31 、必須遺伝子 infA および rpoD にわたるコドン最適化と配列多様性を特徴付けるために以前に使用されてきました 27,28。

この研究では、Rif 結合部位の各位置で考えられるすべての置換にわたる RNAP 変異体のコレクションを生成します。 我々は、Rif 結合相互作用の詳細な遺伝子マップを提供し、変異によって Rif の効力が増加または減少する可能性がある rpoB 521 ～ 526 にわたるαヘリックスを特定します。 この領域では、結合親和性を高めて DNA 損傷を引き起こすことにより、Rif を静菌剤から殺菌剤に変換する単一残基変異体を発見しました。 我々は、殺菌効果が活発な複製に依存していることを示し、プロモーターでRifによってトラップされたRNAPが有害な転写複製競合を引き起こすことを示している。 我々は、高速RNAPを生成するRif結合部位の他の単一残基変異を明らかにし、高い転写速度は細胞のヌクレオチドを枯渇させ、抗生物質に対する感受性を増大させるが、不十分な終結により低温での増殖に有利となるため有益である可能性があることを突き止めた。効率。 高度な進化的保存にも関わらず、自然界では高頻度で発生する機能的な Rif 結合部位の変異を同定しました。 私たちの研究は、Rif 結合部位が RNAP の多機能ドメインであることを示しており、その特徴付けにより、Rif の抗菌能力と転写速度と細菌の生理機能の関係についての理解が広がります。