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Jun 26, 2023

ピクセル

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2934 (2023) この記事を引用 943 アクセス 3 Altmetric メトリクスの詳細 細胞プロセスにおけるシグナル伝達種間の実際の相互作用は、多くの場合

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2934 (2023) この記事を引用

943 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細胞プロセスにおけるシグナル伝達種間の実際の相互作用は、多くの場合、その発現レベルよりも重要です。 フェルスター共鳴エネルギー移動 (FRET) は、2 ～ 10 nm の範囲の近接に対して非常に敏感であるため、分子相互作用を研究するための一般的なツールです。 スペクトルスピルオーバー補正された定量的 (3 キューブ) FRET は、費用対効果が高く多用途なアプローチであり、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡のさまざまなモダリティに適用できますが、さまざまなレベルの自己蛍光によって妨げられる可能性があります。 ここでは、すべてのスペクトル波及因子の正確な決定を可能にする、自家蛍光を含まないセルフリーキャリブレーション標準を利用して、顕微鏡FRET測定にピクセルごとの自家蛍光補正を実装しました。 また、単一画像のインタラクティブな分析と、大規模な画像セットからの定量的 FRET 効率マップの自動作成のための ImageJ/Fiji プラグインも紹介します。 検証のために、シグナル対自家蛍光比およびFRET効率の範囲をカバーするビーズおよび細胞ベースのFRETモデルを使用し、このアプローチを従来の平均自家蛍光/バックグラウンド補正と比較しました。 ピクセルごとの自家蛍光補正は、特に空間的に自家蛍光が変化し、蛍光対自家蛍光の比率が低いサンプル (後者は生理学的発現レベルの場合によく当てはまります) の場合、結果の精度が優れていることが証明されました。

フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）は、蛍光ドナー色素とスペクトル的に適切なアクセプター色素の間の非衝突、非放射エネルギー移動であり、実際の目的では蛍光性が選択されることがよくあります1。 1960 年代後半から、FRET は巨大分子間の近接性を判断するためのツールとして徐々に普及してきました。 エネルギー移動効率 (E) は、ドナー色素とアクセプター色素間の距離の逆 6 乗の関数であり、2 ～ 10 nm の範囲で急速に変化します。 この感度範囲は、回折により分解能が低く制限される光学機器においても、分子レベルの相互作用を確立および比較するための基礎として機能します2。 超解像技術が急速に進歩し、解像度の限界がますます低くなっているにもかかわらず、FRET 技術には十分な余地が残されています3。 顕微鏡で FRET を測定するには、単一分子測定 5,6 からアンサンブルアプローチまで、幅広いアプローチ 4 があり、その多くは高価な機器を必要とせず、サンプルを非破壊で行うことができます 7,8,9。 これらには、既知のドナー/アクセプター化学量論 10 と、ドナー/アクセプター化学量論に依存せずに校正された FRET 効率をもたらす定量的測定モダリティ 11 を備えた、拡大を続ける蛍光タンパク質ベースのバイオセンサーの分野で最適に使用されるレシオメトリック手法が含まれます。 このうち、蛍光寿命イメージング (FLIM) は本質的に定量的な方法ですが、高度な機器が必要です 12,13。一方、スペクトル スピルオーバー補正 (またはスリーキューブ) FRET は費用対効果が高く、汎用性の高いアプローチであり、フローサイトメトリーや従来の手法に適用できます。蛍光顕微鏡検査。 同様に一般的なアクセプター光退色技術 14、15 とは対照的に、タイムラプスおよび 3D 画像解析と組み合わせて使用​​することもできます 11、16。

FRET 測定のすべての方法における主な制限は、信号対雑音比 (SNR) です。 SNR は、信号の期待値を SD で割ったものです。 ここで、さらなる計算に使用されるすべての測定された蛍光強度のノイズが FRET 効率に伝播します。 ピクセルごとに検出された光子のポアソン分布が期待値 λ であると仮定すると、体系的なノイズが無視できる場合、SNR は √λ となるため、強度が低いほど、決定された FRET E の不確実性が大幅に増加すると予想されます。 SNR が低いサンプルは、蛍光色素の量子効率と光安定性を向上させ、より効率的な検出 17 を使用し、FRET 色素ペアを最適化 18,19 し、数学的および統計的アプローチを改善することにより、FRET 分析をより受けやすくすることができます。 23. スペクトルスピルオーバー補正法を使用すると、通常、約 5% 以上の FRET 効率が見られた場合に、既存の分子相互作用について結論付けることができます。